پی سی آر کے رد عمل میں مداخلت کے عوامل

پی سی آر کے رد عمل کے دوران، کچھ مداخلت کرنے والے عوامل کا اکثر سامنا ہوتا ہے۔
پی سی آر کی بہت زیادہ حساسیت کی وجہ سے، آلودگی کو پی سی آر کے نتائج کو متاثر کرنے والے سب سے اہم عوامل میں سے ایک سمجھا جاتا ہے اور یہ غلط مثبت نتائج پیدا کر سکتا ہے۔
یکساں طور پر اہم مختلف ذرائع ہیں جو غلط-منفی نتائج کا باعث بنتے ہیں۔ اگر پی سی آر مکسچر کے ایک یا ایک سے زیادہ ضروری حصے یا ایمپلیفیکیشن ری ایکشن ہی روکا جاتا ہے یا اس میں مداخلت ہوتی ہے تو، تشخیصی پرکھ میں رکاوٹ پیدا ہو سکتی ہے۔ یہ کم کارکردگی اور یہاں تک کہ غلط منفی نتائج کا باعث بن سکتا ہے۔
روک تھام کے علاوہ، نمونے کی تیاری سے پہلے شپنگ اور/یا اسٹوریج کے حالات کی وجہ سے ہدف نیوکلک ایسڈ کی سالمیت کا نقصان ہو سکتا ہے۔ خاص طور پر، زیادہ درجہ حرارت یا ناکافی ذخیرہ خلیوں اور نیوکلک ایسڈ کو نقصان پہنچا سکتا ہے۔ سیل اور ٹشو فکسیشن اور پیرافین ایمبیڈنگ ڈی این اے کے ٹکڑے ہونے اور ایک مستقل مسئلہ کی معروف وجوہات ہیں (اعداد و شمار 1 اور 2 دیکھیں)۔ ان صورتوں میں، یہاں تک کہ زیادہ سے زیادہ تنہائی اور طہارت بھی مدد نہیں کرے گی۔

تصویر 1 | ڈی این اے کی سالمیت پر متحرک ہونے کا اثر
ایگرز جیل الیکٹروفورسس نے ظاہر کیا کہ پوسٹ مارٹم کے پیرافین حصوں سے الگ تھلگ ڈی این اے کا معیار کافی مختلف ہے۔ مختلف اوسط ٹکڑے کی لمبائی کا ڈی این اے فکسیشن کے طریقہ کار پر منحصر نچوڑ میں موجود تھا۔ ڈی این اے کو صرف اس وقت محفوظ کیا گیا تھا جب مقامی منجمد نمونوں اور بفرڈ نیوٹرل فارملین میں طے کیا گیا تھا۔ سخت تیزابیت والے بوئن فکسٹیو یا غیر بفر شدہ، فارمک ایسڈ پر مشتمل فارملین کے استعمال کے نتیجے میں ڈی این اے کا نمایاں نقصان ہوا۔ بقیہ حصہ انتہائی بکھرا ہوا ہے۔
بائیں طرف، ٹکڑوں کی لمبائی کلو بیس جوڑوں (kbp) میں ظاہر کی جاتی ہے۔

تصویر 2 | نیوکلک ایسڈ اہداف کی سالمیت کا نقصان
(a) دونوں کناروں پر 3′-5′ فرق کے نتیجے میں ہدف کے DNA میں وقفہ آئے گا۔ ڈی این اے کی ترکیب اب بھی چھوٹے ٹکڑے پر ہوگی۔ تاہم، اگر ڈی این اے کے ٹکڑے پر پرائمر اینیلنگ سائٹ غائب ہے، تو صرف لکیری امپلیفیکیشن ہوتی ہے۔ سب سے زیادہ سازگار صورت میں، ٹکڑے ایک دوسرے کو بحال کر سکتے ہیں، لیکن پیداوار چھوٹی اور پتہ لگانے کی سطح سے کم ہو گی۔
(b) اڈوں کا نقصان، بنیادی طور پر depurination اور thymidine dimer کی تشکیل کی وجہ سے، H-bonds کی تعداد میں کمی اور Tm میں کمی کا باعث بنتا ہے۔ لمبے وارمنگ مرحلے کے دوران، پرائمر میٹرکس ڈی این اے سے پگھل جائیں گے اور کم سخت حالات میں بھی اینیل نہیں ہوں گے۔
(c) ملحقہ تھامین اڈے ایک TT ڈائمر بناتے ہیں۔
ایک اور عام مسئلہ جو اکثر سالماتی تشخیص میں پایا جاتا ہے وہ ہے فینول-کلوروفارم نکالنے کے مقابلے میں ہدف نیوکلک ایسڈز کا کم از کم اخراج۔ انتہائی صورتوں میں، یہ غلط منفی کے ساتھ منسلک کیا جا سکتا ہے. سیل کے ملبے کے ابلتے ہوئے لیسز یا انزیمیٹک ہضم سے زیادہ وقت بچایا جا سکتا ہے، لیکن یہ طریقہ اکثر ناکافی نیوکلک ایسڈ کے اخراج کی وجہ سے پی سی آر کی حساسیت میں کمی کا باعث بنتا ہے۔

پروردن کے دوران پولیمریز کی سرگرمی کی روک تھام

عام طور پر، روکنا ایک کنٹینر تصور کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے تاکہ تمام عوامل کو بیان کیا جا سکے جو سب سے زیادہ PCR نتائج کا باعث بنتے ہیں۔ سختی سے بائیو کیمیکل معنوں میں، روکنا صرف انزائم کی سرگرمی تک محدود ہے، یعنی یہ ڈی این اے پولیمریز کی فعال سائٹ یا اس کے کوفیکٹر کے ساتھ تعامل کے ذریعے سبسٹریٹ پروڈکٹ کی تبدیلی کو کم یا روکتا ہے (مثال کے طور پر، Taq DNA پولیمریز کے لیے Mg2+)۔
نمونے میں موجود اجزاء یا مختلف بفرز اور ریجنٹس پر مشتمل نچوڑ براہ راست انزائم کو روک سکتے ہیں یا اس کے کوفیکٹرز (مثلاً EDTA) کو پھنس سکتے ہیں، اس طرح پولیمریز کو غیر فعال کر سکتے ہیں اور اس کے نتیجے میں PCR کے منفی نتائج میں کمی یا غلط ہو سکتی ہے۔
تاہم، رد عمل کے اجزاء اور ہدف پر مشتمل نیوکلک ایسڈز کے درمیان بہت سے تعاملات کو بھی 'PCR inhibitors' کے طور پر نامزد کیا گیا ہے۔ ایک بار جب خلیے کی سالمیت تنہائی سے متاثر ہو جاتی ہے اور نیوکلک ایسڈ جاری ہو جاتا ہے تو نمونے اور اس کے آس پاس کے محلول اور ٹھوس مرحلے کے درمیان تعامل ہو سکتا ہے۔ مثال کے طور پر، 'اسکیونرز' غیر ہم آہنگی کے تعامل کے ذریعے سنگل یا ڈبل ​​پھنسے ہوئے ڈی این اے کو باندھ سکتے ہیں اور اہداف کی تعداد کو کم کرکے تنہائی اور تطہیر میں مداخلت کرسکتے ہیں جو بالآخر پی سی آر کے رد عمل کے برتن تک پہنچتے ہیں۔
عام طور پر، پی سی آر روکنے والے زیادہ تر جسمانی رطوبتوں اور ری ایجنٹس میں موجود ہوتے ہیں جو طبی تشخیصی ٹیسٹوں کے لیے استعمال ہوتے ہیں (پیشاب میں یوریا، خون میں ہیموگلوبن اور ہیپرین)، غذائی سپلیمنٹس (نامیاتی اجزاء، گلائکوجن، چربی، Ca2+ آئن) اور ماحول میں موجود اجزاء (فینول) بھاری دھاتیں)

زیادہ مروجہ پی سی آر روکنے والے بیکٹیریا اور یوکرائیوٹک سیلز، نان ٹارگٹ ڈی این اے، ٹشو میٹرکس کے ڈی این اے بائنڈنگ میکرو مالیکیولز اور لیبارٹری کے آلات جیسے دستانے اور پلاسٹک میں پائے جا سکتے ہیں۔ نکالنے کے دوران یا اس کے بعد نیوکلک ایسڈز کو صاف کرنا پی سی آر روکنے والوں کو ہٹانے کا ترجیحی طریقہ ہے۔
آج، مختلف خود کار طریقے سے نکالنے والے آلات بہت سے دستی پروٹوکول کی جگہ لے سکتے ہیں، لیکن 100% ریکوری اور/یا اہداف کی تطہیر کبھی حاصل نہیں ہو سکی۔ ممکنہ روکنے والے اب بھی پیوریفائیڈ نیوکلک ایسڈز میں موجود ہو سکتے ہیں یا پہلے ہی اثر کر چکے ہیں۔ روکنے والوں کے اثرات کو کم کرنے کے لیے مختلف حکمت عملی موجود ہیں۔ مناسب پولیمریز کا انتخاب روکنے والے کی سرگرمی پر اہم اثر ڈال سکتا ہے۔ پی سی آر کی روک تھام کو کم کرنے کے دوسرے ثابت شدہ طریقے پولیمریز کی حراستی کو بڑھا رہے ہیں یا بی ایس اے جیسی اضافی چیزیں لگا رہے ہیں۔
پی سی آر رد عمل کی روک تھام کو اندرونی عمل کوالٹی کنٹرول (آئی پی سی) کے استعمال سے ظاہر کیا جاسکتا ہے۔
ایکسٹرکشن کٹ میں موجود تمام ریجنٹس اور دیگر محلولوں کو نکالنے کے لیے احتیاط برتنی چاہیے، جیسے کہ ایتھنول، ای ڈی ٹی اے، سی ای ٹی اے بی، ایل آئی سی ایل، گ ایس سی این، ایس ڈی ایس، آئسوپروپینول اور فینول، کو اچھی طرح دھونے کے مرحلے سے نیوکلک ایسڈ سے الگ تھلگ کیا جائے۔ ان کی حراستی پر منحصر ہے، وہ PCR کو چالو یا روک سکتے ہیں۔