پی سی آر کے رد عمل میں مداخلت کے عوامل

پی سی آر کے رد عمل کے دوران ، کچھ مداخلت کرنے والے عوامل کا اکثر سامنا کرنا پڑتا ہے۔
پی سی آر کی بہت زیادہ حساسیت کی وجہ سے ، آلودگی کو پی سی آر کے نتائج کو متاثر کرنے والے ایک اہم ترین عوامل میں سے ایک سمجھا جاتا ہے اور یہ غلط مثبت نتائج پیدا کرسکتا ہے۔
اتنے ہی اہم ذرائع ہیں جو غلط منفی نتائج کا باعث بنتے ہیں۔ اگر پی سی آر کے مرکب کے ایک یا زیادہ ضروری حصے یا پروردن کے رد عمل کو خود ہی روکا جاتا ہے یا مداخلت کی جاتی ہے تو ، تشخیصی پرکھ کو رکاوٹ بنایا جاسکتا ہے۔ اس سے کم کارکردگی اور یہاں تک کہ غلط منفی نتائج بھی پیدا ہوسکتے ہیں۔
روک تھام کے علاوہ ، نمونے کی تیاری سے قبل شپنگ اور/یا اسٹوریج کے حالات کی وجہ سے ہدف نیوکلک ایسڈ کی سالمیت کا نقصان ہوسکتا ہے۔ خاص طور پر ، اعلی درجہ حرارت یا ناکافی ذخیرہ خلیوں اور نیوکلک ایسڈ کو نقصان پہنچا سکتا ہے۔ سیل اور ٹشو فکسنگ اور پیرافن ایمبیڈنگ ڈی این اے کے ٹکڑے ہونے اور مستقل مسئلے کی معروف وجوہات ہیں (اعداد و شمار 1 اور 2 دیکھیں)۔ ان معاملات میں ، یہاں تک کہ زیادہ سے زیادہ تنہائی اور طہارت سے کوئی فائدہ نہیں ہوگا۔

چترا 1 | ڈی این اے سالمیت پر متحرک ہونے کا اثر
ایگرز جیل الیکٹروفورسس نے ظاہر کیا کہ ڈی این اے کا معیار پوسٹ مارٹم کے پیرافن حصوں سے الگ تھلگ ہے۔ طے کرنے کے طریقہ کار پر منحصر ہے کہ مختلف اوسط ٹکڑے کی لمبائی کا ڈی این اے نچوڑ میں موجود تھا۔ ڈی این اے کو صرف اس وقت محفوظ کیا گیا تھا جب آبائی منجمد نمونوں میں اور بفرڈ غیر جانبدار فارملین میں طے کیا گیا ہو۔ سخت تیزابیت والے بون فکسٹیو یا بے ساختہ ، فارمیٹک ایسڈ پر مشتمل فارملین کے استعمال کے نتیجے میں ڈی این اے کا نمایاں نقصان ہوا۔ باقی حصہ انتہائی بکھرے ہوئے ہے۔
بائیں طرف ، ٹکڑوں کی لمبائی کا اظہار کلوبیس کے جوڑے (کے بی پی) میں کیا جاتا ہے

چترا 2 | نیوکلیک ایسڈ کے اہداف کی سالمیت کا نقصان
(a) دونوں تاروں پر 3′-5 ′ فرق کے نتیجے میں ہدف ڈی این اے میں وقفہ ہوگا۔ ڈی این اے کی ترکیب اب بھی چھوٹے ٹکڑے پر واقع ہوگی۔ تاہم ، اگر ڈی این اے کے ٹکڑے پر پرائمر اینیلنگ سائٹ غائب ہے تو ، صرف لکیری پروردن ہوتا ہے۔ انتہائی سازگار صورت میں ، ٹکڑے ایک دوسرے کو دوبارہ تیار کرسکتے ہیں ، لیکن پیداوار چھوٹی اور کھوج کی سطح سے نیچے ہوگی۔
(ب) اڈوں کا نقصان ، بنیادی طور پر بدنامی اور تیمائڈائن ڈائمر کی تشکیل کی وجہ سے ، ایچ بانڈز کی تعداد میں کمی اور ٹی ایم میں کمی کا باعث بنتا ہے۔ لمبی لمبی گرمی کے مرحلے کے دوران ، پرائمر میٹرکس ڈی این اے سے دور ہوجائیں گے اور کم سخت حالات میں بھی اینیل نہیں کریں گے۔
(c) ملحقہ تائیمین اڈے ٹی ٹی ڈائمر تشکیل دیتے ہیں۔
ایک اور عام مسئلہ جو اکثر سالماتی تشخیص میں پایا جاتا ہے وہ ہے فینول کلوروفارم نکالنے کے مقابلے میں ہدف نیوکلک ایسڈ کی کم سے زیادہ زیادہ سے زیادہ رہائی۔ انتہائی معاملات میں ، اس کا تعلق جھوٹے منفی سے ہوسکتا ہے۔ ابلتے ہوئے لیسس یا سیل ملبے کے انزیمیٹک ہاضمے کے ذریعہ زیادہ وقت بچایا جاسکتا ہے ، لیکن اس طریقہ کار کے نتیجے میں اکثر نیوکلک ایسڈ کی ناکافی رہائی کی وجہ سے کم پی سی آر حساسیت ہوتی ہے۔

پرورش کے دوران پولیمریز سرگرمی کی روک تھام

عام طور پر ، روک تھام کو کنٹینر کے تصور کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے تاکہ ان تمام عوامل کو بیان کیا جاسکے جو سب سے زیادہ پی سی آر کے نتائج کا باعث بنتے ہیں۔ سختی سے بائیو کیمیکل معنوں میں ، روکنا انزائم ، یعنی کی سرگرمی تک محدود ہے ، یہ ڈی این اے پولیمریز یا اس کے کوفیکٹر (جیسے ایم جی 2+ کے لئے ٹی اے کیو ڈی این اے پولیمریز کے لئے ایم جی 2+) کے ساتھ تعامل کے ذریعے سبسٹریٹ پروڈکٹ کی تبدیلی کو کم یا روکتا ہے۔
نمونے میں موجود اجزاء یا مختلف بفرز اور ریجنٹس پر مشتمل نچوڑ انزائم کو براہ راست روک سکتے ہیں یا اس کے کوفیکٹرز (جیسے EDTA) کو پھنس سکتے ہیں ، اس طرح پولیمریز کو غیر فعال کرتے ہیں اور اس کے نتیجے میں کم یا غلط منفی پی سی آر کے نتائج میں کمی واقع ہوتی ہے۔
تاہم ، رد عمل کے اجزاء اور ہدف پر مشتمل نیوکلیک ایسڈ کے مابین بہت سے تعاملات کو بھی 'پی سی آر انابائٹرز' کے نام سے منسوب کیا گیا ہے۔ ایک بار جب سیل کی سالمیت تنہائی سے متاثر ہوجاتی ہے اور نیوکلیک ایسڈ جاری ہوجاتا ہے تو ، نمونے اور اس کے آس پاس کے حل اور ٹھوس مرحلے کے مابین تعامل ہوسکتا ہے۔ مثال کے طور پر ، 'اسکیوینجرز' غیر ہم آہنگی بات چیت کے ذریعہ سنگل یا ڈبل ​​پھنسے ہوئے ڈی این اے کو باندھ سکتے ہیں اور اہداف کی تعداد کو کم کرکے تنہائی اور طہارت میں مداخلت کرسکتے ہیں جو بالآخر پی سی آر کے رد عمل کے برتن تک پہنچ جاتے ہیں۔
عام طور پر ، پی سی آر روکنے والے زیادہ تر جسمانی سیالوں اور ریجنٹس میں موجود ہوتے ہیں جو کلینیکل تشخیصی ٹیسٹوں (پیشاب میں یوریا ، ہیموگلوبن اور خون میں ہیپرین) ، غذائی سپلیمنٹس (نامیاتی اجزاء ، گلائکوجن ، چربی ، سی اے 2+ آئن) اور ماحول میں اجزاء (فینولز ، بھاری دھاتیں) کے لئے استعمال ہوتے ہیں۔

زیادہ سے زیادہ پی سی آر روکنے والے بیکٹیریا اور یوکریوٹک خلیوں ، نان ٹارگٹ ڈی این اے ، ڈی این اے بائنڈنگ میکرومولیکولس ٹشو میٹرک اور لیبارٹری کے سامان جیسے دستانے اور پلاسٹک میں پایا جاسکتا ہے۔ پی سی آر روکنے والوں کو دور کرنے کے لئے نکالنے کے دوران یا اس کے بعد نیوکلک ایسڈ کی تزکیہ ایک ترجیحی طریقہ ہے۔
آج ، مختلف خودکار نکالنے کا سامان بہت سے دستی پروٹوکول کی جگہ لے سکتا ہے ، لیکن 100 ٪ بازیافت اور/یا اہداف کی تطہیر کبھی حاصل نہیں کی گئی ہے۔ ممکنہ طور پر روکنے والے اب بھی صاف شدہ نیوکلیک ایسڈ میں موجود ہوسکتے ہیں یا پہلے ہی اس کا اثر ہوسکتا ہے۔ روکنے والوں کے اثرات کو کم کرنے کے لئے مختلف حکمت عملی موجود ہیں۔ مناسب پولیمریز کے انتخاب سے روکنے والے کی سرگرمی پر نمایاں اثر پڑ سکتا ہے۔ پی سی آر کی روک تھام کو کم کرنے کے لئے دیگر ثابت شدہ طریقے پولیمریز حراستی میں اضافہ کر رہے ہیں یا بی ایس اے جیسے اضافے کا اطلاق کر رہے ہیں۔
داخلی عمل کوالٹی کنٹرول (آئی پی سی) کے استعمال سے پی سی آر کے رد عمل کی روک تھام کا مظاہرہ کیا جاسکتا ہے۔
نکالنے والی کٹ میں تمام ریجنٹس اور دیگر حلوں کو دور کرنے کے ل kee ، جیسے ایتھنول ، ای ڈی ٹی اے ، سیٹاب ، ایل ای سی ایل ، جی یو ایس سی این ، ایس ڈی ایس ، آئسوپروپنول اور فینول کو نیوکلک ایسڈ کو الگ تھلگ کرنے کے ل. احتیاط برتنی ہوگی۔ ان کی حراستی پر منحصر ہے ، وہ پی سی آر کو چالو یا روک سکتے ہیں۔